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中科項目文章|IF=15, 蛋白組揭示神經毒性保護的重要分子靶點

2019-09-09

關鍵詞:褪黑素、神經炎癥、定量蛋白質組學分析、serpina3n、三甲基氯化錫


01

研究背景
三甲基氯化錫(TMT)是有機錫化合物的代表,通常用作聚氯乙烯(PVC)穩定劑,是一種毒性很高的神經毒劑,可以引起神經炎癥和神經細胞死亡。在實際生產應用中,TMT中毒多與有機錫用做塑料穩定劑有關,從事有機錫塑料穩定劑研究、生產、使用等工作都有可能導致TMT中毒。
一旦中毒,TMT可導致中毒者產生精神錯亂、記憶缺陷和癲癇癥狀。盡管引起了許多悲劇,但TMT誘導的神經毒性的分子機制尚未得到充分研究,也沒有預防或治療策略。
近期,浙江大學醫學院、美國UT Health San Antonio醫學中心、第四軍醫大學以及陸軍軍醫大學的研究團隊合作研究了褪黑素對TMT誘導的神經毒性的保護作用及其潛在機制,并通過定量蛋白質組和生物信息學分析了發現了褪黑素對TMT誘導的神經毒性保護作用的重要分子靶點。
該研究成果于近期發表在《Journal of Pineal Research》上,而中科新生命十分榮幸地參與了蛋白組學的分析工作。


Inhibition of SERPINA3N‐dependent neuroinflammation is essential for melatonin to ameliorate trimethyltin chloride–induced neurotoxicity


IF=15.221


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02

材料準備
作者以C57BL/6J雄鼠為對象,設置了四個組別:對照組、褪黑素處理組(MEL)、TMT處理組(TMT)組以及接受褪黑素治療的TMT處理組(TMT+MEL)組。

03

技術路線


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04

探索攻略
1.  表型分析確認處理有效性
研究團隊通過表型分析來確認TMT的中毒表型,以及褪黑素處理是否有效。在這部分工作中,表型的確認可以分為兩個方面:
1.1 行為學差異
研究人員對于各個組別的小鼠分別進行了癲癇評分、被動回避實驗、新奇物識別實驗以及曠場實驗,來比較各個組別小鼠在行為學上的差異。結果顯示,褪黑素治療顯著減弱了小鼠癲癇的臨床癥狀,同時可防止由TMT引起的神經炎癥導致的行為改變。


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褪黑素可以減輕TMT誘導的異常神經行為
1.2 病理學差異
研究人員接下來檢查了海馬的組織病理學變化。結果顯示,TMT組小鼠海馬神經元顯著丟失,而褪黑素處理明顯減弱了海馬神經元的損傷。


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褪黑素可減輕TMT誘導的海馬神經元損傷

2.分子層面找關鍵差異
2.1 系統差異分析-定量蛋白組學
為了確定褪黑素治療如何保護海馬體免受TMT神經毒性的影響,在TMT處理后第4天分別收集了三個處理組的小鼠海馬體(對照組、TMT組和TMT+mel組),并進行定量蛋白質組學分析,以尋找不同處理的蛋白組表達水平差異。
與對照組相比,TMT組有61種差異表達蛋白質,其中,39種蛋白的表達水平上調,22種蛋白下調。與TMT組相比,TMT+mel組有17種小鼠海馬蛋白顯著下調。將兩次比較獲得的差異蛋白進行維恩分析發現,經TMT處理后顯著上調的6種蛋白被褪黑素處理顯著抑制。


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定量蛋白組學分析比較各組處理的差異表達蛋白
2.2 差異之中找關鍵--關鍵蛋白的篩選與數據驗證
與對照組相比,TMT組SERPINA3N表達差異最大,顯著增加了2.78倍。然而,褪黑素治療顯著抑制了TMT組小鼠海馬中SERPINA3N的表達。為了驗證組學結果,研究人員用qPCR和Western blot分別測定了不同組海馬中的SERPINA3N在mRNA和蛋白質水平的表達,其結果與蛋白質組學分析一致。上述結果表明,褪黑素抑制TMT誘導的SERPINA3N表達。


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褪黑素抑制TMT誘導的SERPINA3N表達
3.生理層面討論褪黑素功能


免疫熒光分析顯示,TMT處理顯著提高了小鼠海馬DG和CA3亞區的gfap表達,表明TMT誘導星形細胞活化并導致星形膠質細胞增生,其特征是伴隨著海馬活化的星形膠質細胞中SERPINA3N和GFAP的表達增加。值得注意的是,褪黑素治療同時抑制了TMT處理小鼠海馬中的GFAPSERPINA3N表達。


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免疫熒光分析蛋白表達差異


隨后,研究人員測定了C3、Gbp2、Serping1、Ccl2和Cxcl10等毒害神經的星形細胞激活標志物的表達水平。結果顯示,與對照組相比,TMT組小鼠C3、Gbp2、Ccl2和Cxcl10的mRNA表達水平增加了436%、516%、495%以及862%。而與對照組相比,TMT+MEL組的上調幅度顯著低于TMT組。

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星形細胞激活標志物檢測
由于已知活化的星形膠質細胞會產生參與神經炎癥的有害促炎細胞因子,研究人員接下來測定了TMT治療小鼠海馬中促炎細胞因子的變化,并測試了褪黑激素治療是否能提供保護。結果表明,在接受TMT處理的小鼠的海馬中,TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA和蛋白表達均呈上調趨勢,而褪黑素治療明顯拮抗了TMT誘導的這些促炎細胞因子的上調。


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促炎細胞因子表達水平檢測
上述結果說明,褪黑素可以抑制TMT誘導的星形細胞活化和促炎細胞因子的產生。
4.過表達動物模型深入驗證SERPINA3N功能
為了進一步闡明褪黑素是否通過抑制SERPINA3N的表達來保護TMT的神經毒性,研究團隊在小鼠模型中過表達SERPINA3N后發現,褪黑素的保護作用被消除。同時,過表達SERPINA3N可抵消褪黑激素對TMT誘導的星形細胞活化和神經炎癥的影響。

05

研究小結
該研究基于定量蛋白質組和生物信息學分析以及體內AAV-Serpina3n轉染,首次表明:
(a)褪黑素通過減弱海馬神經元丟失、抑制癲癇樣癲癇發作和改善記憶缺陷,顯著減輕了TMT誘導的小鼠神經毒害。
(b)褪黑素顯著抑制了TMT誘導的神經炎癥反應和星形細胞活化,表現為炎性細胞因子產生的減少以及神經毒性反應性星形細胞表型標記物的下調。
(c)SERPINA3N不僅在TMT誘導的神經炎癥和神經毒性中起著關鍵作用,同時也是褪黑激素的關鍵靶點,對TMT誘導的神經炎癥和神經毒性有調節作用。
由此可見,褪黑素在臨床實踐中可能是一種有前途和實用的降低TMT誘導的神經毒性的藥物。


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褪黑素通過抑制serpina3n依賴性神經炎癥減輕了TMT誘導的神經毒性

06

小編心得
該研究利用蛋白組學分析大規模篩選,通過對比不同處理找到差異最大的蛋白,結合已報道的蛋白功能去篩選關鍵蛋白,隨后又在數據層面、生理實驗層面進行了多番驗證,最終闡明了褪黑素減輕TMT神經毒害的機制,并獲得了作用靶點,為后續的臨床轉化提供了堅實的基礎。

07

中科蛋白組技術介紹
常規蛋白質組
· 前中科院上海生科院蛋白質研究分析中心,國際HLPP、HPPP人類蛋白質組項目參與者,超過15年經驗積累。
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